GİRİŞ

Akciğer kanseri, tüm kanser türleri arasında erkeklerde ölüme neden olan ilk; kadınlarda ise ikinci kanser türüdür. Dünyada her yıl yaklaşık 1,3 milyon insan akciğer kanserinden ölmektedir. Ancak yeni geliştirilen akciğer kanseri tedavi yöntemleri ile ortalama yaşam süresi ve kalitesi nispeten artmaya başlamıştır (1). Dünya çapında ölüm oranı yüksek olan akciğer kanserlerinin yaklaşık %80’i küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) olarak bildirilmektedir. KHDAK’ler, adenokarsinom ve skuamöz olmak üzere iki alt tipi mevcuttur ve histopatolojik olarak adenokarsinom ve skuamözlerin hücresel karsinomu olarak sınıflandırılır. Adenokarsinomlar ve skuamöz karsinomlar tüm KHDAK’lerin yaklaşık %50’sini temsil eder (1,2).

SMAD4, kimyasal sinyalleri hücre yüzeyinden çekirdeğe doğru taşıyan bir protein ürünü sentezleyen bir gendir. Bu sinyal yolu, dönüştürücü büyüme faktörü (transforming growth factor-TGF)-yolu üzerinden çalışır ve hücrenin çevresel ortamından etkilenebilir. Sinyal oluşumu, TGF-beta (TGF-β) proteininin hücre yüzeyindeki ilgili reseptöre bağlanmasıyla başlar ve bu olay SMAD grubu proteinlerin aktivasyonunu sağlar (3). SMAD proteinleri, bir protein kompleksi oluşturmak için SMAD4’e bağlanır ve oluşan bu yeni kompleks hücre çekirdeğine doğru hareket ederek sinyali iletir. Ayrıca çekirdekteki tümör baskılayıcı genlerin büyümesini ve aktivasyonunu da kontrol eder (4).

Metilasyon, özellikle genlerin promotör bölgelerinde bulunan CpG nükleotit dizilerindeki 5-karbon sitozine bir metil grubunun eklenmesi ile karakterize olan bir süreçtir. Çalışmalar, memeli genomlarının önemli bir kısmının metillenmiş durumda olduğunu göstermiştir (5,6). Genlerdeki metilasyon reaksiyonları gen ekspresyonunu etkiler ve bu nedenle genler inaktive veya aktive edilebilir. Bu çalışmada, SMAD4 geninin akciğer kanserleri oluşumuna katkısını belirlemek amacıyla metilasyon spesifik polimeraz zincir reaksiyonu (MSP) yöntemi ile adenom tipi akciğer kanserlerinde normal ve tümör dokularının promotör bölgesindeki potansiyel metilasyonunu belirleyerek normal dokudan tümöre dönüşüm aşamasındaki değişimleri göstermeyi amaçladık. Çalışmamız bu yönüyle literatürde bir ilk çalışmadır.

YÖNTEMLER

Çalışmamız kesitsel retrospektif bir araştırma olup hasta onamı alınmamıştır. Bu çalışma için, histolojik olarak doğrulanmış ileri evre (evre 3) 10, erken evre (evre 1) ve orta evre (evre 2) adenokarsinomlu akciğer tümör dokularından 5’er adet kesit ve aynı olguların normal akciğer dokusu olarak cerrahi sınırların en dış kısımlarından 5 adet kesit olmak üzere olgu başına 10 adet olmak üzere formalinle fikse edilmiş parafine gömülü doku bloklarında toplam 20 olguya ait 200 kesit slayt doku örneği hazırlandı (7). Hastaların klinik özellikleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Çalışılacak örnek sayısı power analizi ile belirlenmiş olup bu çalışmada kullanılan tüm olgular Trakya Üniversitesi Patoloji Bölümü’nde 2007-2018 yılları arasında akciğer kanseri tanısı almış hastalara ait parafin doku arşivi kullanılmıştır. Tüm dokuların patolojik olarak değerlendirilmesi patoloji anabilim dalında yapılmıştır. Bu çalışma Trakya Üniversitesi Yerel Etik Kurul izni ile yürütülmüştür (onay numarası: 05/21, onay tarihi: 27.02.2013).

Parafine Gömülü Dokulardan Genomik DNA İzolasyonu ve Bisülfit Modifikasyon

Daha önce belirtildiği şekilde seçilmiş dokulardan kesitler elde edilerek slaytlardan kazınma suretiyle tüplere alınmış ve DNA’ları literatürde belirtildiği gibi izole edilmiştir (8). Bu DNA’lar daha sonra spektrofotometrik yöntemle 280 nm ve 260 nm dalga boyunda DNA miktarları belirlendikten sonra analiz edilmiş; ve numuneler daha ileri analiz için +4 ˚C’de saklanmıştır. DNA’ların bisülfit modifikasyonları EpiJET Bisulfite Conversion Kit ve Protokolü’ne uygun olarak yapılmıştır (Thermo Fisher Scientific-USA) (7,8).

SMAD4 Promotörünün Metilasyon Analizi

Genomik DNA’nın sodyum bisülfit modifikasyonu ile DNA’da bulunan tüm metillenmemiş sitozinler timine dönüştürülür fakat bu reaksiyon, metile durumda bulunan sitozinler etkilemediği için potansiyel bir dizi farklılığı oluşturulmaktadır. DNA’nın bu kimyasal modifikasyonundan sonra DNA örnekleri SMAD4 geninin metilasyon analizi için kullanılmıştır. SMAD4 geni dizisi için potanisyel metilasyon bölgelerini ve metilasyona özel primer dizilerini belirleyebilmek için MethPrimer V1.1 beta programı kullanılmıştır (www.urogene.org adresinde mevcuttur) (9).

Metilasyon Spesifik Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yöntemi

SMAD4 gen bölgesinin promotörü için metilasyona özgü primerler aşağıdaki gibidir: İleri 5’: GTAATAATACGGTTTTGGTCGTC-3’, ters: 5’-TCCCACCCCCTAAACGACCGCG-3’, ürün boyutu: 164 baz çifti (bç), Tm: 77,4 ˚C, SMAD4 gen bölgesinin promotörü için kullanılan metillenmemiş bölgeye özel primerler şunlardır: İleri: 5’-GTAATAATATGGTTTTGGTTGTT-3’, ters: 5’-CTCCCACCCCCTAAACAACCACA-3’, ürün boyutu: 163 bç, Tm: 72,3 ˚C. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) koşulları, 95 ˚C’de 10’ için başlatmayı takiben 95 ˚C 45’, 55 ˚C 30’, 72 ˚C 30’x35 döngü ve son olarak 72 ˚C’de 5’ sonlandırma aşamalarından oluşturulmuştur. Metillenmiş ve metillenmemiş PCR ortamı; PCR tamponu 1x, MgCl₂: 2 mM, DMSO: %5 (h/h), dNTP: 12,5 mM, primer ileri: 10 nM, primer ters: 10 nM, taq polimeraz: 1U (5U/µL). Şablon DNA 100 ng, 50 µL’ye kadar dH₂O ile tamamlanmıştır. Metillenmiş ve metillenmemiş insan DNA’ları, pozitif ve negatif kontrol DNA’ları olarak kullanıldı (S8001 | CpGenome™ İnsan Metillenmiş ve Metillenmemiş DNA Standart Seti). Bu DNA’lar, PCR’den önce bisülfit modifikasyon yapılmıştır. Modifiye edilmiş bu DNA örnekleri ile PCR, metilasyona özgü ve metilasyona özgü olmayan primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra PCR ürünleri ultraviyole ışık altında %2 agaroz jel için değerlendirildi (9), tümörler ve metilasyon için normal dokular karşılaştırıldı ve metilasyon oranları belirlendi.

İstatistiksel Analiz

Çalışmanın istatistiksel analizi SPSS 20 programı (IBM Corp, Armonk, NY, ABD) kullanılarak yapıldı. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma ve nitel değişkenler yüzde olarak ifade edildi. MSP sonuçların istatistiksel analizleri yapıldı ve deney ve kontrol grubu sonucu χ² testi ile karşılaştırıldı, p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (10).

BULGULAR

Her un-MSP için 1-3 µL bisülfitle modifiye edilmiş DNA kullanıldı. MSP ve un-MSP ürünleri, etidyum bromür ile boyanarak %2’lik agaroz jeli üzerinde değerlendirildi (Resim 1 A-B). SMAD4 geninin promotöründe beklenen bant boyutu, MSP ve un-MSP için 163-164 bp idi (Resim 1) (11). Sonuç olarak adenokarsinom tümörlerinin yaklaşık 12’sinde (%60)  SMAD4 promotör metilasyonunun mevcut olduğu ve un-metilasyonun %3-10 olduğu, normal akciğer dokularında ise %70 un-metilasyon ve yaklaşık %20 metilasyon görülmüştür (p<0,05). Tümör evrelerine göre değerlendirildiğinde birinci evre tümörlerin %40’ı (4 örnekte), 2. evre tümörlerin %87,5’i (6 örnekte) ve 3. evre tümörlerin %66’sı (2 örnekte) metilasyonda artış gözlenmiştir (Tablo 1).

TARTIŞMA

Kromozom 18q21’de bulunan SMAD4 geni, birçok pankreas ve kolorektal tümörlerde aday bir tümör baskılayıcı gen olarak olarak bilinmektedir. Pankreas ve kolorektal kanserlerde SMAD4 geninde delesyon gibi mutasyon mekanizmalarla inaktive olmasına sebep olan değişimlerin etkili olduğu gösterilmiştir (11). Bu sebeplerden dolayı SMAD4 metilasyonu öncelikle kolorektal ve pankreas kanserlerinde incelenmiştir. MSP, gen metilasyonlarının araştırılması için kullanılan başlıca yöntemdir ve birçok kanser ve diğer hastalık gruplarında başarıyla kullanılmaktadır (12). Literatürde akciğer kanserlerinde SMAD4 metilasyon durumunu gösteren bir çalışma bulunmadığından MSP yöntemini kullanarak SMAD4 promotör bölgesini inceledik. SMAD4, özellikle transkripsiyonel fonksiyonu rolü nedeniyle iyi bir kemoterapötik seçeneği olabilir (13). SMAD4 ekspresyonu ve bağlantılı TGF- β ile artan fonksiyonel gen ekspresyonları ve onkogenez sinyal yolakları aktifleşmesi arasında, özellikle kanser gelişiminde bir ilişki mevcuttur (10,11). Araştırmamız, akciğer adenokarsinomunda SMAD4 metilasyonlarının görülebileceğini göstermiştir. Belki bu şekilde, SMAD4 gen inaktivasyonlarının ve diğer aktif genlerle birlikte akciğer kanserlerinde yaşam beklentisinin azalmasının sebeplerinden biri olabilir. Literatürde bu konuyla ilgili sınırlı bilgi vardır. Bu bilgiler ışığında onkogenez yolakları aktive veya inaktive edebilmenin kanser tedavilerindeki potansiyel önemini gösterir. Bu genin hem epigenetik özelliklerini inceleyen hem de epigenetik inhibisyon mekanizmalarının açıklama çalışmaları yeni kanser kemoterapi ajanları arayışında ilgi çekici olabilir (10,11,14).

Fakat sadece bu yönüyle bile çalışmamız en sık görülen akciğer kanseri türlerinden biri olan adenokarsinom akciğer kanserlerinde SMAD4 metilasyonu olduğunu göstermiştir. Çalışmamız SMAD4 promotör metilasyonu ile adenokarsinom akciğer kanserlerinde ilişkili olabileceğini gösteren nadir bir çalışmadır.

Çalışma Kısıtlılıkları

Çalışmamızda tümör ve normal akciğer dokularında SMAD4 gen metilasyonu ile birlikte RNA ve protein seviyelerinde SMAD4 gen ekspresyonunun çalışılamamış olması bir kısıtlılık oluşturmaktadır.

SONUÇ

Akciğer kanserlerinde SMAD4 için gen ekspresyonu ve yolakları üzerine daha fazla araştırma yapılması gereklidir. Yakın bir gelecekte SMAD4 promotörlerinin metilasyon bölgeleri akciğer kanserlerinde ve bu genin rol oynadığı bilinen diğer kanser türlerinde terapötik hedef olmayı vaat etmektedir. Belki bu sayede mevcut olan kanser tedavilerinin etkinliğini arttırabileceği ve kanser hastaları için yaşam beklentisi/yaşam kalitesi üzerinde olumlu etkileri olabileceğine inanıyoruz.

Teşekkür: Doktor Ömer Yalçın’a patoloji tetkikleri için teşekkür ederim.

Etik Komite Onayı: Bu çalışma Trakya Üniversitesi Yerel Etik Kurul izni ile yürütülmüştür (onay numarası: 05/21, onay tarihi: 27.02.2013).

Hasta Onamı: Çalışmamız kesitsel retrospektif bir araştırma olup hasta onamı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Finansal Destek: Yazar bu çalışma için finansal destek almadığını beyan etmiştir.