ABSTRACT
Objective:
Inflammatory bowel disease (IBD) is an idiopathic disease associated with changes in the immune system and in the intestinal microbiota. The most accepted hypothesis of IBD pathogenesis is thought to be the abnormal immunological response and chronic intestinal inflammation, which is caused by the complex interactions between genetic, environmental factors and the host immune system. Microbial flora is important in the maturation of the immune system. Dysbiosis is defined as changes in intestinal microbiota composition and function. Clinical and experimental studies support that dysbiosis plays a significant role in the etiopathogenesis of IBD. Probiotics are useful live microorganisms that provide the intestinal balance in the host.
In this study, we aimed to evaluate the anti-inflammatory and anti-oxidant activities of Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium longum bacteria in the experimental colitis model.
Methods:
Twenty-four female Wistar-Albino rats and 30 mg 0.5 mL trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) dissolved in 50% ethanol which induced colitis by intrarectal installation. Rats were divided into four groups; healthy control (sham: group A), TNBS colitis (group B), (TNBS + methylprednisolone: group C) and probiotic (TNBS + P: group D). The rats were sacrificed on the 8th day. Macroscopic and microscopic scores, tissue myeloperoxidase (MPO), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) levels were measured.
Results:
Macroscopic and microscopic scores levels in group A were significantly lower than in group B, C and D. Macroscopic and microscopic scores levels in group C were significantly lower than in group B. Macroscopic scores were statistically similar between group C and D. There was a statistically significant difference between the groups in terms of median MDA levels and median SOD levels (p<0.001). There was no statistically significant difference between the groups in terms of median MPO levels (p=0.114). Median MPO levels were 0.27 (0.15-0.30) in group A, 0.44 (0.22-0.61) in group B, 0.28 (0.25-0.50) in group C, and 0.30 (0.25-0.37) in group D (p=0.114). Median MDA levels were 1.1 (1.0-2.8) in group A, 4.3 (3.1-5.5) in group B, 3.8 (3.2-4.2) in group C, and 3.9 (3.1-4.2) in group D (p<0.001). Median SOD levels were 160.7 (150.1-161.7) in group A, 141.6 (137.9-147.3) in group B, 157.6 (155.2-167.7) in group C, and 164.7 (160.3-168.3) in group D (p<0.001). MDA levels were statistically significantly different between each group. These levels were significantly higher in group B, C and D than in group A; statistically similar in group C and D; and statistically higher in group B than in group C and D (p<0.001 & p=0.047). SOD levels were statistically significantly different between each group. They were significantly lower in group B, C and D than in group B; statistically significantly different in group A, C and D; and statistically higher in group D than in group A and C.
Conclusion:
Our study showed that probiotics regulate the balance between anti-oxidant and oxidant systems. Therefore, probiotics can be used as a supportive treatment in inflammatory bowel diseases if promoted by clinical trials.
INTRODUCTION
Probiotics are useful living microorganisms that provide intestinal balance in the host where they are located. The gastrointestinal tract is the colonization site of millions of beneficial or harmful bacteria. Because of its acidic fluid and protective secretions, the stomach contains a small number of bacteria, but certain types of bacteria migrate through the gastrointestinal tract and settle in the intestines, especially the colon (1). 20% of faeces are bacteria mostly from the colon. Bacteria make up most of the flora and more than 60% of the dry weight of the faeces in the columns of normal people. The main bacterial species in the colon are Lactobacillus, Bifidobacterium, Eubacterium, Streptococcus, Coliforms, Clostridium and Saccharomyces. A healthy individual has about 100 trillion bacteria in their intestines. Although they are widely consumed with yogurt and fermented foods in the world, it is found and used in different forms such as various dietary supplements and functional foods (2). The microbial flora contributes to the maturation of the immune system and to the formation of the ability to recognize and destroy pathogenic microorganisms taken from food and from outside. It has an important role in the formation of colonic morphology and control of continuous inflammatory response. By creating a barrier to the colonic mucosa, it prevents the entry of microorganisms and allergens into the body (3,4).
Inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic inflammatory diseases. It has two major types, ulcerative colitis and Crohn’s disease. About 3.5 million people are affected in Europe and the United States. Although the incidence of both diseases has increased all over the world, their etiologies remain uncertain and no treatment method providing cure has yet been found (5). The accepted hypothesis of IBD pathogenesis is that complex interactions between genetics, environmental factors and the host immune system lead to abnormal immune responses and chronic intestinal inflammation. Dysbiosis has been described as changes in intestinal microbiota composition and function. Clinical and experimental studies support that dysbiosis plays an important role in the etiopathogenesis of IBD (6). Recently, the replacement of the intestinal microbiota composition with probiotics or fecal transplantation has been the focus of attention among the supportive and therapeutic methods.
In this study, it was aimed to evaluate the anti-inflammatory and antioxidant activities of the bacteria of Enterococcus Faecium, Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Rhamnosus, Bifidobacterium Bifidum, Bifidobacterium Longum in the experimentally created colitis model and the treatment success of probiotics compared to steroid.
GİRİŞ
Probiyotikler bulundukları konaktaintestinal dengeyi sağlayan, yararlı canlı mikroorganizmalardır. Gastrointestinal sistem yararlı veya zararlı milyonlarca bakterinin kolonizasyon yeridir. Asidik karakterde sıvı ve koruyucu sekresyonlarından dolayı mide çok az miktarda bakteri içerir fakat bakterilerin belirli türleri gastrointestinal sistem boyunca göç ederek, barsaklara özellikle kolana yerleşirler (1). Feçesin %20’sini çoğu kolondan gelen bakteriler oluşturur. Normal insanların kolonlarında floranın büyük bir kısmı ve feçesin kuru ağırlığının %60’dan fazlasını bakteriler oluşturur. Kolondaki ana bakteri türleri Lactobasillus, Bifidobacterium, Eubacterium, Streptococcus, Coliforms, Clostridium ve Saccharomyces türleridir. Sağlıklı bir birey barsaklarında yaklaşık 100 trilyon bakteri taşır. Dünyada yaygın olarak yoğurt ve fermente gıdalarla tüketilmekle birlikte, çeşitli diyet takviyeleri ve fonksiyonel gıdalar gibi değişik formlarda bulunur ve kullanılır (2). Mikrobiyal flora immün sistemin matürasyonuna, besinler ve dışardan alınan patojenik mikroorganizmaları tanıma ve yok etme yeteneğinin oluşmasına katkı sağlar. Kolonik morfolojinin oluşmasında ve sürekli enflamatuvar cevabın kontrolünde önemli role sahiptir. Kolonik mukozaya bariyer oluşturarak mikroorganizma ve allerjenlerin vücuda girişini engeller (3,4).
Enflamatuvar barsak hastalıkları (EBH) kronik enflamatuvar hastalıklardır. Ülseratifkolit ve Crohn hastalığı olmak üzere iki majör tipi vardır. Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 3,5 milyon insan etkilenmektedir. Her iki hastalığın insidansı tüm dünyada artmasına rağmen, etiyolojileri belirsizliğini korumaktadır ve henüz kür sağlayan bir tedavi yöntemi bulunamamıştır (5). EBH patogenezinin en kabul edilen hipotezi, genetik, çevresel faktörler ve konakçı bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimlerin, anormal immün yanıtlara ve kronik intestinal enflamasyona yol açmasıdır. Disbiyozis barsak mikrobiyota bileşiminde ve işlevinde değişiklikler olarak tanımlanmıştır. Klinik ve deneysel çalışmalar disbiyozisin EBH etiyopatogenezinde önemli rol oynadığını desteklemektedir (6). Son zamanlarda barsak mikrobiyota bileşimin probiyotikler veya fekaltransplantasyon ile değiştirilmesi destek ve tedavi edici yöntemler arasında ilgi odağı olmuştur.
Bu çalışmada, deneysel olarak oluşturulmuş kolit modelinde Enterococcus Faecium, Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Rhamnosus, Bifidobacterium Bifidum, Bifidobacterium Longum bakterilerinin anti-enflamatuvar ve antioksidan etkinlikleri ve steroide göre probiyotiklerin tedavi başarısının değerlendirilmesi amaçlandı.
METHODS
This study was carried out in Gazi University Faculty of Medicine Experimental Animals Laboratory. Pathological examinations were carried out in Gazi University Faculty of Medicine, Department of Pathology. In this study, a total of 24 Wistar-Albino female rats with the weight of 200-250 grams were used. All animals were fed with standard feed and water before the experiment.
Four different groups were created with 6 rats in each group. The animals were kept in standard humidity, light (12 hours daylight/12 hours dark) and heat conditions (22-24 ºC) during the experiment and fed with standard rat food. Wire pads were placed inside the cage to prevent coprophagy. Rats were placed in single cages to determine the amount of food and liquid consumed by each rat. Weights of the rats were recorded every day throughout the study to determine weight changes.
Anesthesia to the rats was provided by injecting intramuscular Ketaminehydrochloride (Ketalar, Parke Davis and Eczacıbaşı, İstanbul) at a dose of 50 mg/kg + Xylazinehydrochloride (Rompun, Bayer HealthCare) at a dose of 5 mg/kg. To create experimental colitis, a mixture of 30 mg (80 mg/kg) trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) (92823, picrylsulfonicacidsolution) + 50% ethanol was used. TNBS was purchased from Sigma (Sigma, La Verpaille-re, France).
Group A (n=6): Sham group; The group receiving intrarectal 2 mL of saline for 7 days,
Group B (n=6): The group developing colitis with TNBS and receiving no treatment,
Group C (n=6): The group given oral Prednisol 2mg/day 24 hours after the development of colitis with TNBS,
Group D (n=6): Twenty-four hours after the development of colitis with TNBS, 1 sachet of oral probiotic per day (E. Faecium, L. Acidophilus, L. Rhamnosus, B. Bifidum, B. Longum were given as 3 doses a day with gavage for 7 days.
Monitoring the symptoms: After the animal model was established, rat feces were collected daily. The overall condition of the rats including feces, blood, activity, fur, food intake, and weight was observed.
Surgical method: After anesthesia, which was achieved by applying 50 mg/kg ketamine + 5 mg/kg xylazine intramuscularly, laparotomy was performed with xifopubic median incision in the colitis models and control group, and exploration was performed. Subsequently, transection was performed from the distal of the rectum from the middle of the transverse colon at the lowest possible level and approximately 10 cm colon segment was removed. The removed colon tissue was divided into two equal parts longutidinally. A part of the column sample was detected in 10% formaldehyde. The other half was stored in -80 ºC freezer (Sanyo MDF-U70V) until the day of the procedure. Under deep anesthesia (ketamine 45 mg/kg + xylasin 5mg/kg IM intracardiac), 5 cc blood was collected and the rats were sacrificed.
YÖNTEMLER
Bu çalışma Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’nda yapılmıştır. Patolojik incelemeler Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı’nda gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada toplam 24 adet 200-250 gram ağırlığında Wistar-Albino dişi rat grubu kullanıldı. Deney öncesi tüm hayvanlar standart yem ve su ile beslendi. Her grupta 6 rat olacak şekilde 4 farklı grup oluşturuldu. Hayvanlar deney süresince standart nem, ışık (12 saat gün ışığı/12 saat karanlık) ve ısı koşullarında (22-24 ºC) bulunduruldu ve standart rat yemi ile beslendi. Kaprofajiyi önlemek için kafes içine tel altlıklar yerleştirildi. Her bir ratın yediği yem ve içtiği sıvı miktarının belirlenmesi için ratlar tekli kafeslere konuldu. Ağırlık değişimlerinin belirlenmesi amacıyla çalışma boyunca her gün ratların ağırlıkları kaydedildi.
Ratlara anestezi, intramüsküler ketamin hidroklorür (Ketalar, Parke Davis ve Eczacıbaşı, İstanbul) 50 mg/kg dozunda + ksilazin hidroklorür (Rompun, Bayer HealthCare) 5 mg/kg enjekte edilerek sağlandı. Deneysel kolit oluşturmak için 30 mg (80 mg/kg) trinitro-benzen sülfonik asit (TNBS) (92823, pikirilsülfonik asit çözeltisi + %50 etanol karışımı kullanıldı. TNBS Sigma’dan (Sigma, La Verpaille-re, Fransa) satın alınmıştır.
Grup A (n=6): Sham grubu; İntrarektal 7 gün 2 mL serum fizyolojik alan grup,
Grup B (n=6): TNBS ile kolit oluşturulan ve herhangi bir tedavi almayan grup,
Grup C (n=6): TNBS ile kolit oluşturulduktan 24 saat sonra prednol 2 mg/gün oral verilen grup,
Grup D (n=6): TNBS ile kolit oluşturulduktan 24 saat sonra günde 1 saşe oral probiyotik (E. Faecium, L. Acidophilus, L. Rhamnosus, B. Bifidum, B. Longum) günde 3 doz şeklinde gavajla 7 gün boyunca verildi.
Semptomların gözlemlenmesi: Hayvan modelinin kurulmasından sonra, sıçan dışkıları günlük olarak toplandı. Dışkı, kan, aktivite, kürk, gıda alımı ve kilo dahil olmak üzere sıçanların genel durumu gözlemlendi.
Cerrahi yöntem: İntramüsküler olarak 50 mg/kg ketamin + 5 mg/kg ksilazin uygulanması ile sağlanan anestezi sonrası, kolit modellerinde ve kontrol grubunda ksifo-pubik medyan kesi ile laparatomi yapıldı, eksplorasyon gerçekleştirildi. Takiben transvers kolonun ortasından rektum distalde mümkün olan en aşağı seviyeden transekte edildi ve yaklaşık 10 cm’lik kolon segmenti çıkarıldı. Çıkarılan kolon dokusu longutidinal olarak iki eşit parçaya ayrıldı. Kolon örneğinin bir parçası %10 formaldehit içinde tespit edildi. Diğer yarısı işlem gününe kadar -80 ºC derin dondurucuda (Sanyo MDF-U70V) saklandı. Derin anestezi altında (ketamin 45 mg/kg + ksilazin 5 mg/kg IM intrakardiyak) 5 cc’lik kan alınarak ratlarsakrifiye edildi.
Histopathological Examination Methods
Macroscopic evaluation: Following the longitudinal opening of the removed intestinal sections, they were rapidly washed with normal saline and their macroscopic scorings were done by a pathologist blinded to the groups and treatment for each subject individually, as described by Millar et al. (7) and group averages were calculated.
0 = normal mucosa,
1 = mucosal erythema only,
2 = mild mucosal edema, minor bleeding or minor erosions,
3 = moderate edema, bleeding ulcer or erosion,
4 = severe ulcer, erosion, edema and presence of tissue necrosis.
Microscopic evaluation: Colon segments fixed in 10% formalin were embedded in paraffin blocks. Sections taken from these blocks with a thickness of 5 µ were stained with hematoxylin-eosin. The prepared preparates were examined for the groups by a blind pathologist under the light microscope and microscopic scoring was performed. The scoring system used by Ackerman et al. (8) was modified and calculated separately for each animal and the average score of each group was obtained.
A: Necrosis depth: none = 0; mucosal = 1; mucosal and submucosal = 2; mucosal, submucosal and muscularispropria = 3; in the entire colon wall = 4,
B: Width of necrosis: none = 0; a small area = 1; a moderate area = 2; a large area = 3; common = 4,
C: The degree of inflammation: none = 0; minimal = 1; mild = 2; moderate = 3; serious = 4,
D: Width of inflammation: none = 0; mucosal = 1; mucosal and submucosal = 2; in mucosal, submucosal and muscularispropria = 3; in the entire colon wall = 4.
Histopatolojik İnceleme Yöntemleri
Makroskopik değerlendirme: Çıkarılan barsak bölümlerinin longitudinal biçimde açılmasını takiben, hızla serum fizyolojik ile yıkanarak, gruplara ve tedaviye kör bir patoloji uzmanı tarafından Millar ve ark.’nın (7) tariflediği şekilde makroskopik skorlamaları her bir denek için ayrı ayrı yapıldı ve grup ortalamaları hesaplandı.
0 = normal mukoza,
1 = sadece mukozaleritem,
2 = hafif mukozal ödem, az miktarda kanama ya da küçük erozyonlar,
3 = orta derecede ödem, kanayan ülser yada erozyon,
4 = ciddi ülser, erozyon, ödem ve doku nekrozunun varlığı.
Mikroskopik değerlendirme: %10 formalin içinde tespit edilmiş kolon segmentleri, parafin bloklara gömüldü. Bu bloklardan 5µ kalınlığında alınan kesitler hematoksilen-eosin boyasıyla boyandı. Hazırlanan preparatlar gruplar için gruplara kör bir patoloji uzmanı tarafından ışık mikroskopu altında incelenerek mikroskobik skorlama yapıldı. Skorlama için Ackerman ve ark.’nın (8) kullandığı skorlama sistemi modifiye edilerek her hayvan için ayrı ayrı hesaplandı ve her grubun ortalama skoru elde edildi.
A: Nekrozun derinliği: yok = 0; mukozal = 1; mukozal ve submükozal = 2; mukozal, submükozal ve muskülaris propria = 3; tüm kolon duvarında = 4,
B: Nekrozun genişliği: yok = 0; küçük bir alan = 1; orta derecede bir alan = 2; büyük bir alan = 3; yaygın = 4,
C: Enflamasyonun derecesi: yok = 0; minimal = 1; ılımlı = 2; orta derecede = 3; ciddi= 4,
D: Enflamasyonun genişliği: yok = 0; mukozal = 1; mukozal ve submükozal = 2; mukozal, submükozal ve muskülaris propria’da = 3; tüm kolon duvarında = 4.
Preparation of Tissues for Tissue Myeloperoxidase Activity and Myeloperoxidase Measurment
It is based on the oxidation of H2O2 by homogenate and the reduction of O-dianicide and measuring the reduced O-dianicide at 410 nm. 130 mg intestinal mucosa was homogenized with 1.3 mL cold 20 mM EDTA. 1 mL of the homogenate is taken and placed in eppendorf tubes and centrifuged at +4 degrees for 15 minutes at 20.000 g. Supernatant was discarded and it was sonicated for 60 seconds with PELLET 1.3 mL of 50 mM buffer (pH 6), then centrifuged again at +4 degrees at 20.000 g for 15 minutes. The supernatant was transferred to new eppendorfs. The myeloperoxidase (MPO) level was studied from this supernatant. Optical density at 410 nm was read against the blind. That occurring at 1 Unit = min at 37 ºC was accepted as optical density change. Specific activity was evaluated as = U/g tissue.
Doku Miyeloperoksidaz Aktivitesi için Dokuların Hazırlanması ve Miyeloperoksidaz Ölçümü
H2O2’nin homogenat tarafından oksitlenerek O-dianisidi’nin redüklenmesi ve redükte O-dianisid’inin 410 nm’de ölçülmesi esasına dayanır. 130 mg barsak mukozası 1,3 mL soğuk 20 mM’lik EDTA ile homojenize edildi. Homojenattan 1’er mL alınıp ependorf tüplerine konuldu ve 20,000 g’de 15 dk + 4 derecede santrifüj edildi. Süpernatan atılıp PELLET, 1,3 mL 50 mM’lik tampon (pH 6) ile 60 snsonike edildi, sonra 20,000 g’de 15 dk + 4 derecede tekrar santrifüj edildi. Süpernatan yeni ependorflara aktarıldı. Bu süpernatandan miyeloperoksidaz (MPO) düzeyi çalışıldı. 410 nm’de optik dansite köre karşı okundu. 1 Ünite= 37 oC’de dk oluşan optik dansite değişimi olarak kabul edildi. Spesifik aktivite= U/g doku olarak değerlendirildi.
Malondialdehit Level, Homogenizing Tissue Samples for Superoxide Dismutase Activity
Tissue samples were homogenized in ice with 1/10 phosphate buffer saline (pH: 7.4) in cold. Homogenates were centrifuged at 15.000 rpm for 15 minutes in a cooled centrifuge, and tissue malondialdehyde level and tissue superoxide dismutase (SOD) activity were determined from supernatants.
Malondialdehit Düzeyi, Süperoksitdismutaz Aktivitesi için Doku Örneklerinin Homojenize Edilmesi
Doku örnekleri 1/10 oranında fosfat buffersalin (pH: 7,4) ile buz içinde, soğukta homojenize edildi. Homojenatlar soğutmalı santrifüjde 15,000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilip, süpernatantlardan doku malondialdehit (MDA) düzeyi ve doku süperoksitdismutaz (SOD) aktivitesi tayini yapıldı.
Intestinal Tissue Malondialdehyde Analysis
Tissue malondialdehyde (MDA) levels were determined according to the method described by Ohkawa et al. The principle of this method; After the binding of the homogenate proteins with sodium dodecyl sulfate, the MDA in the sample was performed according to the spectrophotometric measurement of the red color connected to the complex formed by thiobarbituric acid under ambient pH of 3.5.
Barsak Dokusu Malondialdehit Analizi
Doku MDA düzeyleri Ohkawa’nın tarif ettiği yönteme göre tayin edildi. Bu yöntemin ilkesi; homojenattaki proteinlerin sodyum dodesil sülfat ile bağlanmasından sonra örnekte bulunan MDA’nın ortam pH’sı 3,5 olduğu koşullarda tiobarbitürik asit ile oluşturduğu komplekse bağlı kırmızı rengin spektrofotometrik ölçümüne göre yapıldı.
Superoxide Dismutase Analysis in Colon Mucosa Tissue
The SOD activity was measured spectrophotometrically by this color intensity, as defined by Yi-Sun, by the formation of O2˙- with xanthinxanodinoxidase and forming a colored compound with NBT. The greater the SOD activity in the environment, the less the intensity of the resulting color will be, since it will eliminate O2˙-‘.
Kolon Mukozası Dokusunda Süperoksitdismutaz Analizi
SOD aktivitesi, Yi-Sun’un tanımladığı, ksantininksantinoksidaz ile O2˙- oluşturması ve bunun da NBT ile renkli bir bileşik oluşturarak bu renk şiddetinin spektrofotometrik olarak ölçüldü. Ortamdaki SOD aktivitesi ne kadar fazla ise O2˙- ’yi ortadan kaldıracağı için oluşan rengin şiddeti o kadar az olacaktır.
Statistical Analysis
Statistical analysis of the data was done using SPSS v.17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) software. The Kruskal-Wallis test and Mann-Whitney Utest were used as post-hoc tests for the analysis of macroscopic scores, microscopic scores and biochemical parameters between the groups. Data were expressed as mean ± standard deviation. The means of the variables in the groups were drawn by selecting Boxplot. The value of p<0.05 between the results was considered statistically significant.
İstatistiksel Analiz
Verilerin istatistiksel analizi SPSS v.17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) programı kullanılarak yapıldı. Gruplar arasındaki makroskopik skorlar, mikroskobik skorlar ve biyokimyasal parametrelerin analizi için Kruskal-Wallis testi ve Mann-Whitney U-testi post-hoc test olarak kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. Gruplardaki değişkenlerin ortalamaları Boxplot seçilerek çizildi. Sonuçlar arasındaki p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
RESULTS
In group A, there was no weight loss, color change in feathers and stool changes in rats, and food intake was normal during the experiment. After the development of the animal model, decreased appetite, increased stool frequency, bloody stool, and coarse hairy appearance were observed in group B, C, and D.
There was no statistically significant difference between the groups in terms of median MPO levels (p=0.114).
There was a statistically significant difference between the groups in terms of median MDA levels (p=0.002). When the factors causing this difference were examined, it was found that the median MDA levels of group B, C and D were statistically higher compared to group A (p<0.001). At the same time, the median MDA levels of group C and D were statistically lower than group B (p<0.001 and p=0.047). The median MDA level of group D was statistically higher than group C (p=0.047) (Figure 1, 2).
There was a statistically significant difference between the groups in terms of median SOD levels (p<0.001). When the conditions causing the difference in question were examined, it was found that the median SOD level of group B was statistically lower compared to group A and the median SOD level of group D was statistically significantly higher (p<0.001). At the same time, the median SOD levels of group C and D were statistically higher than group B (p<0.001). The median SOD level of group D was statistically higher than group C (p<0.001). The median SOD levels were statistically similar between group A and group C (p=0.106) (Table 1).
In group A, there was no statistically significant decrease in body weight on the 8th day compared to the 1st day. In group B, there was a statistically significant decrease in body weight on the 8th day compared to the 1st day (p<0.001). There was a statistically significant decrease in body weight on the 8th day compared to the 1st day in group C (p<0.001). In group D, there was a statistically significant decrease in body weight on the 8th day compared to the 1st day (p<0.001).
There was a statistically significant difference among the groups in terms of weight loss (p<0.001). When the factors causing the difference in question were examined, it was found that, the average weight loss in groups B, C and D was statistically higher compared to group A (p<0.001). The mean weight loss between group B and C, group B and D, and group C and D were found to be statistically similar (p=0.550; p=0.077 and p=0.608) (Table 2).
There was a statistically significant difference among the groups in terms of median macroscopy scores (p<0.001). In the investigation of this difference, it was found that the median macroscopy scores of group B, C and D were statistically higher compared to group A (p<0.001). At the same time, the median macroscopy score of group B was statistically higher than that of group C and D (p=0.002 and p<0.001). The median macroscopy scores were statistically similar between group C and D (p=0.093) (Table 3).
DISCUSSION
Probiotics have regulatory effects on the intestinal mucosa. These effects include receptor antagonism, receptor expression, binding and expression of adapter proteins, expression of negative regulator signal molecules, induction of microRNAs, endotoxin tolerance, and stimulation of the secretion of immunomodulatory proteins, lipids and metabolites to modulate the immune system. Probiotics not only have activating effects on the immune system, but they also have a suppressive effect. It can affect hemostasis, inflammation and immunopathology pathways with direct or indirect effect on the immune system (1). Probiotics pass the testinal epithelium and reach the M-cells, which are immunomodulators in the payer plates. M-cells transmit probiotic bacteria and their soluble proteins to mucosalenfoid tissue and initiate immunregulation. Antimicrobial activity increases and as a result, mucosal immunoglobulin A also increases. It activates goblet cells located in the mucosa, stimulates mucous secretion, prevents the pathogens to attach the epithelium and to settle in the tissue. It enhances mucosal integrity by strengthening the connections between epithelial cells. It inhibits the binding of lipopolysaccharides to the CD14 receptor, reducing nuclear factor-κβ activation and the production of proinflammatory cytokines. It has regulatory effects on B and T lymphocyte functions located in laminapropria. They reduce the secretion of tumor necrosis factor-alpha and interferon gamma, which play a central role in the formation of testinal inflammation of probiotics. They stimulate regulatory T-cells via interleukin-10 and transforming growth factor-beta. Thus, they display a regulatory effect on inflammation. Lactobacillus and Bifidobacterium species are quite common probiotic species and they are found naturally in the gastrointestinal tract. These bacteria are beneficial bacteria that help the digestive process (9).
IBD are chronic inflammatory diseases that progress with remission and activation. The etiopathogenesis of IBD is still not fully known. It is accepted that it occurs as a result of genetic and environmental factors, and mutual interaction between luminalmicroflora and immune system. Although antibiotics and immunomodulating drugs have an important role in the treatment of these diseases, the ideal treatment method for IBD is still under discussion. In recent years, doubts about that intestinal microbiota changes trigger susceptibility to many gastrointestinal diseases have increased. As a result, attention has focused on the use of probiotics in treatment.
Numerous studies on colitis models formed with TNBS and on patients with IBD have also confirmed anti-inflammatory activities of probiotics (4,9,10). Although the mechanisms regarding how probiotics reduce IBD symptoms are not known, it is known that they have a role in the change of the composition of bacteria in the gastrointestinal system; they compete in holding the epithelium with pathogenic microorganisms and prevent their infection development; they regulate the function of mucosal immune cells; they stimulate the formation of antimicrobial factors such as bacteriocin, hydrogen peroxide, acetic acid, and lactic acid, and inhibit the proliferation of pathogenic microbes; they increase the barrier functions of the mucosa by increasing the inter-epithelial connections and providing mucosal integrity; and they induce T-cell apoptosis (11).
In this study, we preferred the colitis model formed with TNBS due to the development of chronic inflammation, no occurrence of spontaneous remission, and development of inflammation similar to IBD pathogenesis. Subsequently, we examined the colon samples taken from rats microscopically and macroscopically. Activation of neutrophils, macrophages, lymphocytes, and mast cells for any reason and the formation of reactive oxygen metabolites, which occur as a result of oxidative stress in the tissue, cause mucosal impairment and ulceration, and form the pathogenesis of intestinal inflammation.
Therefore, in this study, we determined the SOD, MPO, and MDA tissue levels, which are inflammation, oxidative stress and fibrotic markers, and compared the groups in terms of the tissue levels of these molecules. In this way, we investigated the effects of probiotics on inflammatory and antioxidant markers, which are expected to exist on the mucosa at the very early stage of inflammation.
When the sham group (group A), control group (group B), group receiving steroid treatment (group C), and group taking probiotic (group D) were compared in terms of weight differences on the 1st and 8th days, there was a statistically significant difference among the groups in the weight measurements on the 1st and 8th days. When the groups were compared among themselves, while there was a significant difference in weight loss between the sham group and colitis forming groups, the weight loss was statistically similar among the control group, standard group and test group. This supported the subjects to be selected homogeneously. This may be due to the fact that the rats were not fed 24 hours before the colitis induction and the oral intake of rats receiving anesthesia was reduced because they were administered IR TNBS.
Compared to the sham group, colitis formed groups showed a marked difference in the macroscopic appearance of the colon. In colitis-formed groups, the colon was necrozed, edematous, and rigid, and wall thickness was increased. In groups with colitis, the uterus was adhered to the colon, the spleen was small in size, and the pancreas was hyperemic. In the sham group, the colon was completely normal in macroscopic and microscopic appearance, and the pathological features observed in the groups where colitis was formed in the uterus, spleen and pancreas were not found. While there was microscopically prominent colonic inflammation, erosion, ulceration, necrosis in colitis groups, no pathological findings were found in preparates belonging to the sham group. This difference confirmed us that TNBS was an effective chemical agent in creating a chronic colitis model.
Inflammatory process in IBD and experimental colitis occurs by infiltration of leukocytes such as neutrophils, monocytes and lymphocytes into the colon mucosa. Leukocytes are the main source of free oxygen radicals. Reactive oxygen radicals cause cell and tissue level damage by doing peroxidation of lipid membranes, protein denaturation and DNA damage. MPO is the most frequently released enzyme from azurophilic granules, found in neutrophils (12). Neutrophil infiltration in inflamed tissue facilitates the emergence of potent cytotoxic oxidants through the MPO enzyme (13). Studies have shown that MPO activity correlates with the severity of tissue damage in TNBS colitis and increases more in the colitis groups than in the control groups, and is also a marker of infiltration of neutrophils (13,14). Domek et al. (15) investigated MPO activities in the treatment groups according to colitis groups in the rats that they formed as colitis model and suggested that neutrophil infiltration and activation played an important role and this was determined by the level of MPO in the tissue. Karmeli et al. (16) compared the effects of cyclooxygenase-2 inhibitors in the colitis model in rats and stated that with treatment, MPO activities decreased 61% compared to subjects in the colitis model. In our study, the MPO levels of the group receiving steroid and the group receiving probiotics were very close to the sham group. The MPO level of the group taking probiotics was higher than the group taking steroids. Although MPO level was higher in the experimental colitis model compared to other groups, no statistically significant difference was found. Although there was no significant difference in MPO values among the groups, MPO values were lower in the sham and treatment groups than in the colitis model.
MDA increase is the most important laboratory indicator of lipid peroxidation in tissues in clinical and experimental studies (17). In acute inflammation, activated neutrophils leave the circulation and enter the mucosa and submucosa of the intestine, causing excessive production of lipid mediators, lactoferrin, proteases, reactive oxygen and nitrogen derivatives that contribute to inflammatory damage (18). Aytac et al. (19) showed that ilioprost significantly reduced tissue MDA levels in the colitis model they formed with acetic acid. In our study, the MDA level was significantly higher in the colitis group and the groups that formed colitis and received treatment compared to the sham group, and the MDA level was lower in the probiotic group compared to the steroid group, and this was statistically significant. When MPO and MDA levels were evaluated, low values compared to the control group supported the probability of probiotics to have anti-inflammatory activity, but not as much as steroid.
SOD is the major defense system against superoxide anions. SOD catalyzes the conversion of superoxide to hydrogen peroxide. It is the primary protector against oxidant molecules. Three types of SOD have been identified; those located in mitochondria-SOD, in cytosol [(Cu), Zn-SOD], and in extracellular matrix [(EC)-SOD]. EC-SOD is released from endothelial and stromal cells. It tends to decrease in IBD patients. Cu, Zn-SOD is released from the epithelium dominantly and decreases in inflammation. Plasma and tissue levels are low in IBD patients. SOD activity in normal intestinal mucosa is lower than in the liver and lung. This level decreases even more in inflammatory conditions (20). Kuralay et al. (21) showed that SOD levels decreased in response to oxidative stress in the experimental colitis model. Grisham et al. (22) found low SOD activity in the colitis model they created with TNBS. Patel et al. (23), in an experimental study, they compared the sham group given 3 groups as 500 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg IR in the colitis model stimulated with PAR-2 agonistitrypsin TNBS and the groups given only TNBS and they examined MPO, MDA, SOD levels. While oxidative enzymes, macroscopic score and microscopic score were high in the group applied 5 mg/kg, antioxidant enzyme levels were low.
In our study, a statistically significant difference was detected among the groups in terms of SOD levels. Compared to the sham group, the median SOD level was statistically lower in the colitis-formed group not receiving treatment. The median SOD level of the probioticic receiving group was statistically higher than the other groups. Also, remarkably, the SOD level was higher in the probiotic group than the sham group. This situation supported the antioxidant activity of probiotics.
Our study supports that probiotics regulate the balance between antioxidant and oxidant systems.
TARTIŞMA
Probiyotiklerin barsak mukozasında düzenleyici etkileri vardır. Bu etkiler reseptör antagonizmi, reseptör ekspresyonu, adaptör proteinlerin bağlanması ve ekspresyonu, negatif regülatör sinyal moleküllerinin ekspresyonu, mikroRNA’ların indüklenmesi, endotoksin toleransı ve bağışıklık sistemini modüle etmek için immünomodülatör proteinlerin, lipidlerin ve metabolitlerin salgılanmasının uyarılmasından oluşmaktadır. Probiyotiklerin immün sistem üzerine sadece aktive edici etkileri yoktur aynı zamanda baskılayıcı etkide oluştururlar. İmmün sistem üzerine direkt veya indirekt etki ile hemostaz, enflamasyon ve immünopatoloji yolaklarını etkileyebilir (1). Probiyotiklerin testinal epiteli geçerek payer plaklarındaki immünmodülatör olan M hücrelerine ulaşırlar. M hücreleri probiyotik bakterileri ve onların çözünür proteinlerini mukozallenfoid dokuya iletir ve immünoregülasyonu başlatır. Anti-mikrobiyal aktivite artar ve sonuç olarak mukozal immünoglobulin A artar. Mukozada yerleşik goblet hücrelerini aktive ederek mukus salgısını uyarır, epitele patojenlerin tutunmasına ve dokuya yerleşmesine engel olur. Epitel hücreleri arası bağlantıları güçlendirerek mukozal bütünlüğü artırır. Lipopolisakkaritlerin CD14 reseptörüne bağlanmasını inhibe ederek nükleer faktör-κβ aktivasyonunu ve proenflamatuvar sitokinlerin üretimini azaltır. Laminapropriada yerleşik B ve T lenfosit fonksiyonları üzerine düzenleyici etkileri vardır. Probiyotiklerin testinal enflamasyonun oluşmasında merkezi rol oynayan tümör nekroz faktörü-alfa ve interferon gama sekresyonunu azaltırlar. Regülatuvar T-hücrelerini interlökin-10 ve dönüştürücü büyüme faktörü-beta aracılığı ile uyarırlar. Böylece enflamasyon üzerine düzenleyici etki gösterirler. Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri oldukça yaygın probiyotik türleridir ve gastrointestinal sistemde doğal olarak da bulunurlar. Bu bakteriler sindirim sürecine yardımcı olan faydalı bakterilerdir (9).
EBH remisyon ve aktivasyonlarla seyreden kronik enflamatuvar hastalıklardır. EBH’nin etiyoptagonezi hala tam olarak bilinmemektedir. Genetik, çevresel faktörler, luminalmikroflora ve immün sistem arasındaki karşılıklı etkileşim sonucu ortaya çıktığı kabul edilmektedir. Antibiyotikler ve immünomodülatör ilaçlar bu hastalıkların tedavisinde önemli yere sahip olmakla beraber, EBH için ideal tedavi yöntemi hala tartışılmaktadır. Son yıllarda, barsak mikrobiyotası değişimlerinin birçok gastrointestinal hastalığa yatkınlığı tetiklediğine dair şüpheler artmıştır. Bunun sonucunda da dikkatler probiyotiklerin tedavide kullanılmasına yoğunlaşmıştır. TNBS ile oluşturulan kolit modellerinde ve EBH’li hastalarda yapılan çok sayıdaki çalışma daprobiyotiklerin anti-enflamatuvar etkinlikleri doğrulanmıştır (4,9,10). Probiyotiklerin EBH semptomlarını nasıl azalttığı ile ilgili mekanizmalar bilinmemesine rağmen, gastrointestinal sistemdeki bakterilerin kompozisyonun değişiminde rol oynadıkları, patojen mikro organizmalar ile epitele tutunmada yarışa girerek onların enfeksiyon oluşumunu engelledikleri, mukozal immün hücrelerin fonksiyonunu düzenledikleri, bakteriosin, hidrojen peroksit, asetik asit, laktik asit gibi antimikrobiyal faktörlerin oluşumunu uyararak patojen mikropların çoğalmasını inhibe ettikleri, epitel arası bağlantıları artırıp mukozal bütünlüğü sağlayarak mukozanın bariyer fonksiyonlarını artırıcı etki gösterdikleri ve T-hücre apoptozisini indükledikleri bilinmektedir (11).
Bu çalışmada kronik enflamasyon oluşturması, spontanremisyon gelişmemesi, EBH patogenezine benzer enflamasyon oluşması nedeni ile TNBS ile oluşturulmuş kolit modelini tercih ettik. Takiben, sıçanlardan alınan kolon örneklerini mikroskobik ve makroskobik olarak inceledik. Herhangi bir nedenle nötrofillerin, makrofajların, lenfositlerin, mast hücrelerinin aktivasyonu ve dokuda oksidatif stres sonucu oluşan reaktif oksijen metabolitleri oluşumu mukozal bozulmaya ve ülserasyona yol açması barsak enflamasyonunun patogenezini oluşturur. Bu nedenle biz bu çalışmada enflamasyon, oksidatif stres ve fibrotik belirteçler olan, SOD, MPO, MDA doku düzeylerini belirledik ve grupları bu moleküllerin doku düzeyleri açısından birbirleri ile karşılaştırdık. Bu şekilde enflamasyonun çok erken döneminde mukozada var olması beklenilen enflamatuvar ve antioksidan belirteçler üzerinde probiyotiklerin etkilerini araştırdık.
Sham grubu (grup A), kontrol grubu (grup B), steroid tedavisi alan grup (grup C), probiyotik alan grup (grup D) 1. ve 8. gün kilo farkı yönünden karşılaştırıldığında grupların kendi içerisinde 1. ve 8. gün kilo ölçümlerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılık mevcuttu. Gruplar kendi arasında karşılaştırıldığında sham grubu ile kolit oluşturulan gruplar arasında kilo kaybı açısından anlamlı farklılık mevcut iken, kontrol grubu, standart grup ve test grubu arasında kilo kaybı istatistiki olarak benzer bulundu. Bu da deneklerin homojen seçildiğini desteklemekteydi. Bu durum kolit indüksiyonunun 24 saat öncesinden itibaren sıçanlara yem verilmemesi, ayrıca İR-TNBS verilmesi dolayısıyla anestezi alan sıçanların oral alımlarının azalmasına bağlı olabilir.
Kolit oluşturulmuş gruplar, sham grubu ile karşılaştırıldığında, kolonun makroskopik görünümü belirgin farklılık göstermekteydi. Kolit oluşturulmuş gruplarda kolon nekroze, ödemli, rijit görünümde idi ve duvar kalınlıkları artmıştı. Kolit oluşturulmuş gruplarda uterus kolona yapışmış, dalak boyutları küçük ve pankreas hiperemik görünümdeydi. Sham grubunda kolon makroskopik ve mikroskobik olarak tamamen normal görünümdeydi, uterus, dalak ve pankreasta kolit oluşturulan gruplarda izlenen patolojik özellikler izlenmedi. Kolit gruplarında mikroskobik olarak belirgin kolonik enflamasyon, erezyon, ülserasyon, nekroz mevcutken, sham grubuna ait preparatlarda herhangi bir patolojik bulguya rastlanmadı. Bu farklılık bize TNBS’nin kronik kolit modeli oluşturmakta etkin bir kimyasal ajan olduğunu doğrulamıştır.
EBH’lerinde ve deneysel kolitte enflamatuvar süreç; nötrofil, monosit ve lenfosit gibi lökositlerin kolon mukozasına infiltrasyonu ile oluşur. Lökositler serbest oksijen radikallerinin ana kaynağıdır. Reaktif oksijen radikalleri, lipidmembranların peroksidasyonu, protein denaturasyonu ve DNA hasarı yaparak hücre ve doku düzeyinde hasara yol açarlar. MPO nötrofillerde bulunan, azurofilik granüllerden en sık salınan enzimdir (12). Enflamasyonlu dokuda nötrofilin filtrasyonu, MPO enzimi aracılığıyla, güçlü sitotoksik oksidanların ortaya çıkmasını kolaylaştırır (13). Yapılan çalışmalarda MPO aktivitesinin, TNBS kolitindeki doku hasarının ciddiyeti ile korele olduğu ve kolit gruplarında kontrol gruplarına göre daha fazla yükseldiği ayrıca nötrofilin filtrasyonunun bir belirteci olduğu gösterilmiştir (13,14). Domek ve ark. (15) kolit modeli oluşturdukları sıçanlarda kolit gruplarına göre tedavi gruplarında MPO aktivitelerini araştırmışlar ve nötrofilin filtrasyon ve aktivasyonunun önemli rol oynadığını bunun da dokudaki MPO düzeyi ile belirlendiğini öne sürmüşlerdir. Karmeli ve ark. (16) sıçanlardaki kolit modelinde COX-2 inhibitörlerinin etkileri karşılaştırılmış ve tedaviyle MPO aktivitelerinin kolit modelindeki deneklere göre %61 azaldığını belirtmişlerdir. Bizim çalışmamızda steroid alan grup, probiyotik alan grubun MPO düzeyi sham grubuna çok yakın değerlerdeydi. Probiyotik alan grubun MPO düzey isteroid alan gruptan yüksek bulundu. Deneysel kolit modelinde MPO düzeyi diğer gruplara göre yüksek olmasına rağmen istatistiki anlamlı farklılık bulunmadı. Gruplar arasında MPO değerlerinde anlamlı farklılık bulunmamasına rağmen, MPO değerlerinin sham ve tedavi grubunda kolit modeline göre düşük değerlerdeydi.
Malondialdehit artışı dokularda lipit peroksidasyonun klinik ve deneysel çalışmalarda en önemli laboratuvar göstergesidir (17). Akut enflamasyonda aktive nötrofiller dolaşımdan ayrılarak barsağın mukoza ve submukozasına girer ve enflamatuvar hasara katkıda bulunan lipit medyatörlerin, laktoferrin, proteazlar, reaktif oksijen ve nitrojen türevlerinin aşırı üretimine neden olur (18). Aytac ve ark. (19) asetik asit ile oluşturdukları kolit modelinde ilioprostun doku MDA düzeylerini anlamlı şekilde düşürdüğünü gösterdiler. Bizim çalışmamızda sham grubuna göre kolit grubunda ve kolit oluşturulup tedavi alan gruplarda MDA düzeyi anlamlı olarak yüksekti ve probiyotik alan grupta MDA düzeyi steroid alan gruba göre daha düşüktü ve bu durum istatistiki olarak anlamlıydı. MPO ve MDA düzeyleri değerlendirildiğinde steroid kadar olmasada kontrol grubuna göre değerlerin düşük olması probiyotiklerin anti-enflamatuvar etkinliğinin olabileceğini destekler nitelikteydi.
SOD, süperoksit anyonlara karşı majör savunma sistemidir. SOD süperoksidin hidrojen perokside dönüşümünü katalizler. Oksidan moleküllere karşı primer koruyucudur. Üç tür SOD tespit edilmiştir. Mitokondride-SOD bulunan, sitozolde bulunan [(Cu), Zn-SOD], ekstraselüler matrikste bulunan [(EC)-SOD]. EC-SOD endotel ve stromal hücrelerden salınır EBH hastalarında düşme eğilimindedir. Cu, Zn-SOD dominant olarak epitelden salınır ve enflamasyonda düşer. EBH hastalarında plazma ve doku seviyesi düşüktür. Normal barsak mukozasında SOD aktivitesi karaciğer ve akciğere oranla düşük oranlarda bulunmaktadır. Bu seviye enflamatuvar durumlarda daha da düşer (20). Kuralay ve ark. (21), deneysel kolit modelinde SOD seviyelerinin oksidatif strese cevap olarak azaldığını göstermişlerdir. Grisham ve ark. (22) TNBS ile oluşturdukları kolit modelinde SOD aktivitesini düşük bulmuşlardır. Patel ve ark. (23) yaptığı deneysel çalışmada PAR-2 agonistitripsin TNBS ile uyarılan kolit modelinde İR olarak 500 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg olarak 3 gruba verilmiş sham grubu ve yalnızca TNBS verilen gruplar karşılaştırılarak MPO, MDA, SOD düzeylerine bakılmış 5 mg/kg uygulanan grupta oksidatif enzimler, makroskopik skor ve mikroskobik skor yüksek bulunurken, antioksidan enzim düzeyleri düşük bulunmuş. Çalışmamızda gruplar arasında SOD düzeyleri yönünden istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edildi. Sham grubuna göre, kolit oluşturulan tedavi almayan grubun medyan SOD düzeyi istatistiksel anlamlı olarak daha düşük, probiyotik alan grubunun medyan SOD düzeyi ise istatistiksel anlamlı olarak diğer gruplara göre daha yüksekti. Ayrıca dikkat çekici olarak SOD düzeyi probiyotik alan grupta sham grubuna oranla bile daha yüksekti. Bu durum probiyotiklerin antioksidan etkinliğini destekler nitelikteydi. Çalışmamız probiyotiklerin antioksidan ve oksidan sistemler arasındaki dengeyi düzenlediğini desteklemektedir.
CONCLUSION
As a result, probiotics can be used as supportive therapy to classical therapy with their antioxidant effects. However, clinical studies are needed to show that probiotics regulate mucosal defense systems with changes in microbiota and may be effective in treatment.
