ABSTRACT
Conclusion:
It was determined that the cytotoxic effect of the synthesized graphene oxide varies depending on the exposure time.
Results:
After 24 hours, 48 hours and 72 hours, IC50 values were measured as 206.18 μg/mL, 108.98 μg/mL, and 55.54 μg/mL, respectively. It was determined that the IC50 value decreased as the incubation time increased.
Methods:
Synthesis of graphene oxide was done by Hummers method. The cytotoxic effects of graphene oxide were determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay in human embryonic kidney cells (HEK293). After 24 hours, 48 hours and 72 hours of graphene oxide incubation at different doses, the IC50 values were calculated which 50% percentage of cell viability.
Objective:
Graphen oxide, a carbon-based material, is considered as a potential material for many biomedical applications such as cell labeling, cell imaging, biosensors, drug release studies, due to its physical and chemical properties. Graphene oxide can be synthesized by more than one method. In this study, it was aimed to evaluate the cytotoxic effects of the graphenoxide samples we synthesized.
INTRODUCTION
Carbon is one of the most abundant elements in the earth's crust. Carbon-based materials have many different application areas due to their high chemical resistance ability, efficient mechanical properties, low weight characteristics and high dispersibility in the body. Materials with different properties are formed by the bonding of carbon atoms to each other in different ways. Multilayer graphene, graphene oxide (GO), carbon nanotubes, nano diamonds and reduced GOs are carbon derivatives used in biomedical systems (1).
Graphene was first described as crystal graphitic films by Nobel laureates Andre Geim and Konstantin Novoselov. Graphene, which has a two-dimensional structure, is 1 atom thick and has the appearance of a honeycomb formed by the bonding of sp2 hybrid carbon atoms. Graphenes, specific surface area (2630 m2G-1), high charge mobility (200,000 cm2 V-1·S-1), high Young’s modulus (~1.0 TPa), high thermal conductivity (~5000 Wm-1·K-1) and high optical transmittance (~97.7%) have unique thermal, electrical and mechanical properties (2-4). Because of these properties, the use of graphene-based materials in various biomedical applications, including tissue engineering, biosensing, gene delivery and cancer therapy, is increasing day by day (1,5).
GO is a chemically modified form of graphene and graphene is hydrophobic while GO is hydrophilic. This feature of GO has made it suitable for use as a drug delivery agent, cellular imaging probes and biosensors in biological systems (1,6,7). GO contains both aromatic (sp2) and aliphatic (sp3) domains. Its surface is even wider to allow electrostatic interaction, and it allows drug binding. Therefore, it is also compatible with drug release studies (5,8). The functionality of GO as a toxic or biocompatible material depends on its composition, size, surface, shape, functional groups, charge, coating and solute medium. In the literature, more than one method is used for the synthesis of GO (9,10).
In this study, it was aimed to synthesize GO and evaluate the cytotoxic effect of synthesized GO in embryonic kidney cells.
GİRİŞ
Karbon, yer kabuğunda en çok bulunan elementlerden biridir. Karbon bazlı malzemeler, yüksek kimyasal direnç kabiliyeti, verimli mekanik özellikleri, düşük ağırlıklı karakterleri ve vücutta yüksek oranda dağılma yeteneğine sahip olmaları nedeniyle birçok faklı uygulama alanına sahiptir. Karbon atomlarının birbirlerine farklı şekillerde bağlanmasıyla özellikleri birbirinden farklı malzemeler oluşmaktadır. Birkaç katmanlı grafenler, grafen oksit (GO), karbon nanotüpler, nano elmaslar ve indirgenmiş GO’lar biyomedikal sistemlerde kullanılan karbon türevleridir (1).
Grafen ilk olarak Nobel ödüllü Andre Geim ve Konstantin Novoselov tarafından kristal grafitik filmler olarak tanımlanmıştır. İki boyutlu bir yapıya sahip olan grafen, 1 atom kalınlığında ve sp2 hibrit karbon atomlarının bağlanmasıyla oluşan bal peteği görünümündedir. Grafenler, özgül yüzey alanı (2630 m2G-1), yüksek yük mobilitesi (200.000 cm2 V-1·S-1), yüksek Young modülü (~1.0 TPa), yüksek termal iletkenlik (~5000 Wm-1·K-1) ve yüksek optik geçirgenlik (~%97,7) gibi benzersiz termal, elektriksel ve mekaniksel özelliklere sahiptir (2-4). Bu özellikler nedeniyle grafen bazlı malzemelerin, doku mühendisliği, biyo-algılama, gen iletimi ve kanser tedavisi de dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalarda kullanımı gün geçtikçe artmaktadır (1,5).
GO, grafenin kimyasal olarak modifiye edilmiş bir formudur ve grafen hidrofobikken, GO hidrofiliktir. Bu özelliği GO’nun biyolojik sistemlerde ilaç dağıtım ajanı, hücresel görüntüleme probları ve biyosensör olarak kullanılmasını elverişli kılmıştır (1,6,7). Hem aromatik (sp2) hem de alifatik (sp3) alanları içermesi nedeniyle GO'nun yüzeyi elektrostatik etkileşime izin verecek şekilde daha da geniştir ve ilaç bağlanmasına olanak sağlar. Dolayısıyla ilaç salınımı çalışmalarına da uygunluk göstermektedir (5,8). GO’nun toksik veya biyouyumlu bir malzeme olarak işlevselliği, bileşimine, boyutuna, yüzeyine, şekline, fonksiyonel gruplarına, yüküne, kaplamasına ve çözünen ortama bağlıdır. Litaratürde GO’nun sentezlenmesinde birden çok yöntem kullanılmaktadır (9,10).
Bu çalışmada GO’nun sentezlenmesi ve sentezlenen GO’nun sitotoksik etkisinin embriyonik böbrek hücrelerinde değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
METHODS
Graphen Oxide Synthesis
GO synthesis was carried out by the modified Hummers method (11). All chemicals used in the synthesis of GO were used in analytical purity: Sulfuric acid (H2SO4) (MERCK, 7664-93-9, Germany), phosphoric acid (H3PO4) (MERCK, 7664-38-2, Germany), Graphite, Potassium Permanganate (KMnO4) (ISOLAB, 7722-64-7, Germany), hydrogen peroxide (H2O2) (30% wt) (MERCK, 1085972500), hydrochloric acid (HCl) (38% wt) (ISOLAB, 7647-01-0, Germany), anhydrous ethanol (ISOLAB, 64-17-5, Germany), sodium hydroxide (NaOH) (MERCK, 106498.1000, Germany).
For the synthesis of GO, 360 mL of H2SO4 and 40 mL of H3PO4 were placed in a beaker and mixed at constant temperature at 200 rpm. Then 3 g of graphite and 18 g of KMnO4 were slowly added to the solution. This reaction was stirred at 40-45 °C for 16 hours. The suspension, which was stirred for 16 hours for the synthesis of GO, was transferred to a beaker containing 400 g of ice and mixing was continued. While the suspension was mixed with ice, 3 mL of H2O2 (30% by weight) was added dropwise. The resulting mixture was centrifuged at 3000 rpm for 45 minutes. After centrifugation, the supernatant (acid) was discharged into the waste bin. GO was obtained by washing the pellets and then drying them in an oven.
Characterization of Graphen Oxide
In order to determine the functional groups in the obtained GO structure, Fourier Transform Infrared (FT-IR) analysis was performed in the range of 4000-400 cm-1 using FT-IR spectroscopy (Nicholet FT-IR Spectrometer). The images of the samples were taken with the Transmission Electron Microscope (Jeol JEM 2100 plus).
Cell Culture
Commercially available human embryonic kidney cells HEK293T (CRL-1573) (The American Type Culture Collection-ATCC; Manassas, VA, USA) were cultured in a 37 °C, 5% CO2 incubator in the medium prepared with 89% Dulbecco’s modified eagle medium, 9% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic solution (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin). When the cells reached 70-80% density, they were first washed with Dulbecco’s phosphate buffer saline and then removed from the flask with 0.25%. Trypsin-EDTA. The trypsin-EDTA-cell suspension was centrifuged at 120xg for 5 min. After centrifugation, the supernatant was discarded and fresh medium was added to the cell pellet. Cells were incubated by seeding in 96-well plates (1x104 cells/well). All chemicals were commercially available (Euroclone S.p.A.; Via Figino-Italy).
Application of Graphene Oxide and MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Test
The MTT test was used to measure cellular metabolic activity in the evaluation of cell viability, proliferation and cytotoxicity. This colorimetric assay uses metabolically active cells to convert the yellow tetrazolium salt MTT into purple formazan crystals. NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzymes in living cells convert MTT to formazan. Using dimethyl sulfoxide (DMSO) to dissolve insoluble formazan crystals, the absorbance of the resulting colored solution is measured in a spectrophotometer. Darker wells contain more metabolically active living cells, and the color is lighter in wells with reduced cell viability (12,13).
In our study, in order to determine the effective dose (IC50) of GO, cells were seeded in 96-well plates at 1x104 cells/well. Twenty four hours after cell cultivation, control group was treated with fresh medium, experimental groups were treated with GO at different concentrations (1000-500-250-125-62.5-31.25-15.62-7.81-3.90 µg/mL). It was incubated for 24, 48 and 72 hours. At the end of the experiment, the medium was removed from all wells. 100 µL of fresh medium and 10 µL (5 mg/mL) of MTT solution were added to the wells and the cells were incubated for 3 hours. At the end of the incubation period, 100 μL of DMSO was added to each well and absorbance values were measured at 570 nm in an ELISA microplate reader (Multiskan GO-Thermo). By using optical density values, dose (IC50) values for GO, which reduced cell viability by 50%, were determined with the GraphPad Prism 9 program.
Measurements were made in 3 repetitions and the results were expressed as mean values, statistical evaluation was not made.
YÖNTEMLER
Grafen Oksit Sentezi
GO sentezi modifiye Hummers yöntemi ile gerçekleştirilmiştir (11). GO sentezinde kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta kullanılmıştır: Sülfürik asit (H2SO4) (MERCK, 7664-93-9, Almanya), fosforik asit (H3PO4) (MERCK, 7664-38-2, Almanya), grafit, potasyum permanganat (KMnO4) (ISOLAB, 7722-64-7, Almanya), hidrojen peroksit (H2O2) (%30 ağırlık) (MERCK, 1085972500), hidroklorik asit (HCl) (%38 ağırlık) (ISOLAB, 7647-01-0), Almanya), susuz etanol (ISOLAB, 64-17-5, Almanya), sodyum hidroksit (NaOH) (MERCK, 106498.1000, Almanya).
GO sentezi için 360 mL H2SO4 ve 40 mL H3PO4 behere konularak sabit sıcaklıkta 200 rpm’de karıştırılmıştır. Ardından 3 g grafit ve 18 g KMnO4 yavaşça solüsyona eklenmiştir. Bu reaksiyon 40-45 °C sıcaklıkta 16 saat boyunca karıştırılmıştır. GO sentezlenmesi için 16 saat boyunca karıştırılan süspansiyon, içinde 400 g buz olan behere aktarılmış ve karıştırılmaya devam edilmiştir. Süspansiyon buzla birlikte karışırken, içine 3 mL H2O2 (%30 ağırlıkça) damla damla eklenmiştir. Elde edilen karışım 3000 rpm’de 45 dakika boyunca santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası süpernatant (asit) atık kutusuna boşaltılmıştır. Pelletlerin yıkanması ve ardından etüvde kurutulmasıyla GO elde edilmiştir.
Grafen Oksitin Karakterizasyonu
Elde edilen GO yapısında bulunan fonksiyonel grupların tespiti için Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopi (Nicholet FT-IR Spektrometresi) kullanılarak 4000-400 cm-1 aralığında FT-IR analiz yapılmıştır. Geçirmeli elektron mikroskobu (Jeol JEM 2100 plus) ile numunelerin görüntüleri alınmıştır.
Hücre Kültürü
Ticari olarak temin edilen insan embriyonik böbrek hücreleri HEK293T (CRL-1573) (The American Type Culture Collection-ATCC; Manassas, VA, USA) %89 Dulbecco’s modified eagle medium, %9 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum ve %1 antibiyotik solüsyonu (100 U/mL penisilin ve 100 U/mL streptomisin) ile hazırlanan besiyerinde 37 °C, %5 CO2 inkübatöründe kültüre edilmiştir. Hücreler %70-80 yoğunluğa ulaşınca önce Dulbecco’s fosfat buffer saline ile yıkanmış, sonrasında %0,25 tripsin-EDTA ile flask zemininden kaldırılmıştır. Tripsin-EDTA-hücre süspansiyonu 120xg’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası süpernatant atılarak hücre peleti üzerine taze besiyeri eklenmiştir. Hücreler 96 kuyucuklu plakalara (1x104 hücre/kuyucuk) ekilerek inkübe edilmiştir. Tüm kimyasallar ticari olarak temin edilmiştir (Euroclone S.p.A.; Via Figino-Italy).
Grafen Oksit Uygulanması ve 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) Testi
Hücre canlılığı, proliferasyon ve sitotoksisite değerlendirilmesinde hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için MTT testi kullanılmıştır. Bu kolorimetrik test, sarı tetrazolyum tuzu olan MTT’yi mor formazan kristallerine dönüştürmek için metabolik olarak aktif hücreleri kullanır. Canlı hücrelerdeki NAD(P)H bağımlı oksidoredüktaz enzimleri MTT’yi formazana dönüştürür. Çözünmeyen formazan kristallerini çözmek için dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılarak, oluşan renkli çözeltinin absorbansı spektrofotometrede ölçülür. Daha koyu olan kuyucuklarda metabolik olarak daha aktif canlı hücreler vardır, hücre canlılığının azaldığı kuyucuklarda renk daha açıktır (12,13).
Çalışmamızda GO’nun etkin dozunun (IC50) belirlenmesi amacı ile hücreler 96 kuyucuklu plakalara 1x104 hücre/kuyucuk olacak şekilde ekilmiştir. Hücre ekiminden 24 saat sonra kontrol grubu taze besiyeri ile deney grupları farklı konsantrasyonda GO (1000-500-250-125-62,5-31,25-15,62-7,81-3,90 µg/mL) ile 24, 48 ve 72 saat inkübe edilmiştir. Deney süresi sonunda tüm kuyucuklardan besiyeri uzaklaştırılmıştır. Kuyucuklara 100 μL taze besiyeri ile 10 μL (5 mg/mL) MTT solüsyonu eklenmiş ve hücreler 3 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda her kuyucuğa 100 μL DMSO ilave edilmiş ve absorbans değerleri 570 nm’de ELISA mikroplaka okuyucuda (Multiskan GO-Thermo) ölçülmüştür. Optik dansite değerleri kullanılarak GraphPad Prism 9 programı ile GO için hücre canlılığının %50 azalmasını sağlayan doz (IC50) değerleri belirlenmiştir.
Ölçümler 3 tekrarlı yapılmıştır ve sonuçlar ortalama değer olarak ifade edilmiştir, istatistiksel değerlendirme yapılmamıştır.
RESULTS
Fourier Transform Infrared Spectroscopy Analysis
FTIR Spectra are given in Figure 1. Between 3000-3500 cm-1, a broad peak is observed, corresponding to the stretching and bending vibration of the OH groups of water molecules adsorbed on GO. This peak indicates that GO has a strong hydrophilic structure. The characteristic peaks at 1735 cm-1 indicates the carboxyl C=O group, and the peak at 1630 cm-1 indicates the aromatic C=C group. The absorption peaks at 2920 cm-1 and 2850 cm-1 correspond to the stretching vibrations of CH2. The absorption peaks at 1200 cm-1 indicate the stretching vibration of the C-O bond of the carboxylic acid. It shows the presence of absorption bonds in the range of 2925 cm-1, 2119 cm-1, 1768 cm-1, 1631 cm-1, 1380 cm-1, 916 cm-1 and 534 cm-1.
Morphological Characterization
Looking at Figure 2, it is seen that GO has a partially uniform transparent morphology due to its characteristic monolayer feature. Due to the large specific surface area formed by the oxygenated functional groups during the oxidation process, numerous bends and irregular wrinkles are observed on the surface (14).
MTT Results
HEK293 cells were treated with different concentrations of GO (1000-500-250-125-62.5-31.25-15.62-7.81-3.90 µg/mL). It was observed that GO decreased cell viability depending on time and dose (Figure 3). IC50 values were calculated as µg/mL and given in Table 1.
DISCUSSION
Since carbon is one of the most common elements in nature, it is known that the biocompatibility of carbon materials is higher than other inorganic materials. In particular, graphite has been used in our daily lives for hundreds of years without critical toxicity issues. Due to the unique physical and chemical properties of graphene, which is a single layer of graphite, its use in biological studies is increasing day by day (1,2,3,7).
In this study, it was aimed to determine the cytotoxic effect of the synthesized GO on the viability of human embryonic kidney cells. For this purpose, the effects of 1000-500-250-125-62.5-31.25-15.62-7.81-3.90 µg/mL concentrations of GO on HEK293 cells were evaluated by MTT analysis, which was evaluated depending on mitochondrial activity. According to the results obtained, cell viability was found to be over 75% at the incubation period of 24 and 48 hours and at the concentrations of 125-62.5-31.25-15.62 µg/mL. When GO incubation was 72 hours, cell viability decreased below 65% at values above 62.5 µg/mL concentration. IC50 values showing 50% viability concentrations for 24, 48 and 72 hour incubations were calculated as 206.18 µg/mL, 108.98 µg/mL and 55.54 µg/mL, respectively. It was determined that when the incubation period with GO increased, mitochondrial damage increased, thus negatively affecting cell viability.
Today, there are many in vitro and in vivo studies investigating the biological effects of different graphene derivatives (4,6,9). Zhang et al. (15) found in their study on PC12 cells that the cytotoxic effect of graphene derivatives with different structures was directly related to the graphene structure. In another study investigating the effects of graphene, Wu et al. (16) showed that nano zinc oxide did not show toxic effects on cell viability, oxidative stress, mitochondrial depolarization and membrane damage in A549 cells when bonded with graphene.
GO, one of the graphene derivatives, is interesting for its use in biological systems due to its hydrophilic structure. Due to the wide application area of GO, a comprehensive understanding of the cytotoxicity of GO is required for the safe and sustainable development of GO-based technologies (6). In this study, we aimed to observe the effect of GO, which we synthesized by using the modified Hummers method, on HEK293 cells.
Wang et al. (17) evaluated the biocompatibility of GO, which they synthesized by using the modified Hummers method, in human fibroblast cells and mice. While the application of GO at a dose of less than 20 μg/mL did not show toxicity in human fibroblast cells, it showed significant cytotoxic effects such as decreased cell adhesion, inducing apoptosis, penetrating into lysosomes, mitochondria and cell nuclei at doses above 50 μg/mL. On the mice, it was determined that low and medium doses of GO did not show significant toxicity, but at high doses (0.4 mg) it exhibited chronic toxicity with accumulation in the liver, spleen and kidney, and caused lung granuloma. In a study on human erythrocytes, it was reported that GO showed dose-dependent hemolytic activity, and the particle size of GO samples also played a critical role in hemolic activity (18). In a study investigating the effects of nanoGO on cardiomyoblast cell line, incubation with 20, 40, 60, 80 and 100 μg/mL nano-GO for 24 hours caused mitochondrial hyperpolarization, free radical production, and DNA damage at concentrations of 40, 60, 80, 100 μg/mL (19). Lammel et al. (20) showed that the cytotoxic effect of GO was dose-dependent through plasma membrane damage, and that GO damaged the structural integrity of the plasma membrane by establishing a strong physical interaction with the phospholipid bilayer. They also reported that GO could penetrate the plasma membrane, resulting in altered cell morphology and an increased number of apoptotic cells (20).
Ünal et al. (4) investigated the effect of different graphene derivatives in their study and showed that the viability of A549 human lung epithelial carcinoma cells was 17% even at the highest dose of 1000 µg/mL of GO. GO showed the greatest effect on MCF-7 breast cancer cells at the lowest dose tested, 1.96 µg/mL, and it was found to cause 11% death. However, they reported that the same graphene derivatives did not show a significant cytotoxic effect in healthy 293-T human embryonic kidney epithelial cells (4). However, Hu et al. (21) stated that the effect of GO was greatly attenuated by incubation with 10% fetal bovine serum, due to the extremely high protein adsorption ability of GO. In another in vitro study, it was reported that low-dose GO had no effect on the morphology, viability and membrane integrity of the A549 cell line, but it could cause a dose-dependent oxidative stress and cause a decrease in cell viability at high doses (22). Similar to the studies, in our study, it was observed that cell viability of HEK293 cells that apllied different concentrations of GO decreased depending on time and dose.
Study Limitations
Molecular studies are needed to determine the cytotoxic effect of GO and to elucidate its interaction with the cell. In this sense, our study can be considered as a preliminary study to investigate the effect of GO.
TARTIŞMA
Karbonun, doğada en yaygın bulunan elementlerden biri olmasından dolayı, karbon esaslı malzemelerin diğer inorganik malzemelere kıyasla biyouyumluluğunun daha yüksek olduğu bilinmektedir. Özellikle grafit, kritik toksisite sorunları olmadan yüzlerce yıldır günlük hayatımızda kullanılmaktadır. Tek bir grafit tabakası olan grafenin benzersiz fiziksel ve kimyasal özelliklerinden dolayı biyolojik çalışmalarda kullanımı gün geçtikçe artmaktadır (1,2,3,7).
Bu çalışmada sentezlediğimiz GO’nun insan embriyonik böbrek hücrelerinin canlılığı üzerine sitotoksik etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla GO’nun 1000-500-250-125-62,5-31,25-15,62-7,81-3,90 µg/mL konsantrasyonlarının HEK293 hücreleri üzerindeki etkisini mitokondriyel aktiviteye bağlı olarak değerlendirilen MTT analizi ile yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre 24 ve 48 saat inkübasyon süresinde ve 125-62,5-31,25-15,62 µg/mL konsantrasyonlarında hücre canlılığı %75’in üzerinde bulunmuştur. GO inkübasyonu 72 saat olduğunda ise 62,5 µg/mL konsantrasyonunun üzerindeki değerlerde hücre canlılığı %65’in altına düşmüştür. Yirmi dört, 48 ve 72 saat inkübasyonları için %50 canlılık konsantrasyonlarını gösteren IC50 değerleri sırasıyla 206,18 µg/mL, 108,98 µg/mL, 55,54 µg/mL olarak hesaplanmıştır. GO ile inkübasyon süresi arttığında mitokondriyel hasarın artırdığı, dolayıasıyla hücre canlılığı üzerine olumsuz etki gösterdiği belirlenmiştir.
Günümüzde farklı grafen türevlerinin biyolojik etkilerinin araştırıldığı in vitro ve in vivo birçok çalışma yapılmaktadır (4,6,9). Zhang ve ark. (15) PC12 hücrelerinde yaptıkları çalışmada farklı yapıya sahip grafen türevlerinin sitotoksik etkisinin grafen yapısı ile direkt ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. Grafenin etkilerinin araştırıldığı farklı bir çalışmada da Wu ve ark. (16) nano çinko oksitin A549 hücrelerinde oluşturduğu hücre canlılığı, oksidatif stres, mitokondrial depolerizasyon ve membran hasarı üzerindeki toksik etkilerinin grafenle bağlandığında göstermediği tespit edilmiştir.
Grafen türevlerinden biri olan GO, hidrofilik yapısından dolayı biyolojik sistemlerde kullanımı için ilgi çekici olmaktadır. GO’nun geniş uygulama alanı nedeniyle, GO tabanlı teknolojilerin güvenli ve sürdürülebilir gelişimi için GO’nun sitotoksisitesinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması gerekmektedir (6). Biz de bu çalışmamızda modifiye Hummers yöntemi ile sentezlediğimiz GO’nun HEK293 hücrelerinde oluşturduğu etkiyi gözlemlemeyi amaçladık.
Wang ve ark. (17) modifiye Hummers yöntemi ile sentezledikleri GO’nun biyouyumluluğunu insan fibroblast hücrelerinde ve fareler üzerinde değerlendirmişlerdir. GO’nun 20 μg/mL’den daha düşük dozda uygulanması insan fibroblast hücrelerinde toksisite göstermezken, 50 μg/mL’nin üzerindeki dozlarda hücre adezyonunda azalma, apoptozu indükleme, lizozomlara, mitokondriye ve hücre çekirdeğine girme gibi belirgin sitotoksik etkiler gösterdiğini belirtmişlerdir. Fareler üzerinde ise düşük ve orta doz uygulanan GO’nun belirgin toksisite göstermediği, fakat yüksek dozlarda (0,4 mg) karaciğer, dalak ve böbrekte birikim ile birlikte akciğer granülomu gibi kronik toksisite sergilediği tespit edilmiştir. İnsan eritrositleri üzerinde yapılan bir çalışmada GO’nun doza bağlı hemolitik aktivite gösterdiği, ayrıca GO numunelerinin parçacık boyutunun da hemolik aktivitede kritik rol oynadığı bildirilmiştir (18). Kardiyomiyoblast hücre hattı üzerine nanoGO’nun etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada 20, 40, 60, 80 ve 100 μg/mL nano-GO ile 24 saat inkübasyonun mitokondriyal hiperpolarizasyona, sebest radikal üretimine ve 40, 60, 80, 100 μg/mL konsantrasyonlarda DNA hasarına sebep olduğu gözlemlenmiştir (19). Lammel ve ark. (20), GO’nun oluşturduğu sitotoksik etkinin plazma zarı hasarı yoluyla doza bağımlı olarak gerçekleştirdiğini, GO’nun fosfolipid çift tabakası ile güçlü bir fiziksel etkileşim kurarak plazma zarının yapısal bütünlüğüne zarar verdiğini göstermişlerdir. Ayrıca, GO’nun plazma zarına nüfuz edebildiğini, bunun da değişmiş hücre morfolojisi ve artan sayıda apoptotik hücre ile sonuçlanabileceğini bildirmişlerdir (20).
Ünal ve ark. (4) farklı grafen türevlerinin kanser hücrelerine etkisini araştırdıkları çalışmalarında; A549 insan akciğer epitelyal karsinoma hücrelerinde GO’nun 1000 µg/mL’lik en yüksek dozunun dahi %17 oranında ölüme yol açtığını, MCF-7 meme kanseri hücrelerinde en fazla etkiyi gösteren test edilen en düşük doz olan 1,96 µg/mL’lik dozun %11 oranında ölüme yol açtığını tespit etmişlerdir. Fakat aynı grafen türevlerinin sağlıklı 293-T insan embriyonik böbrek epitel hücrelerinde anlamlı sitotoksik bir etki göstermediği rapor etmişlerdir (4). Fakat Hu ve ark. (21), GO’nun etkisinin, %10 fetal bovin serumu ile inkübasyon yoluyla büyük ölçüde zayıflatıldığını, bunun nedeninin ise GO’nun son derece yüksek protein adsorpsiyon kabiliyetine sahip olması olarak belirtmişlerdir (21). İn vitro yapılan bir başka çalışmada da düşük doz GO’nun A549 hücre hattının morfolojisine, canlılığına ve membran bütünlüğüne etkisinin olmadığı, ancak doza bağımlı bir oksidatif strese neden olabileceğini ve yüksek dozlarda hücre canlılığında azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir (22). Yapılan çalışmalara benzer olarak bizim çalışmamızda da HEK293 hücrelerine uygulanan farklı konsantrasyonlarda GO’nun hücre canlılığını süre ve doza bağlı olarak azalttığı gözlemlenmiştir.
Çalışmanın Kısıtlılıkları
GO’nun sitotoksik etkisinin belirlenmesinde ve hücre ile etkileşiminin aydınlatılmasında moleküler düzeyde çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bu anlamda, çalışmamız GO’nun etkisinin araştırılması için bir ön çalışma olarak kabul edilebilir.
CONCLUSION
As a result, more studies are needed to increase the usability of graphene derivatives synthesized by different methods in biomedical applications and to evaluate long-term toxicity/biocompatibility data.
